ELISA – øvelse
At demonstrere specifik binding mellem antigen og antistof samt at vise et eksempel på moderne serologisk teknik. (serologi: serumvidenskab. Altså videnskab om blodvæske)
ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) (Assay: analyse, styrkebestemmelse, prøvesten) er betegnelser for en familie af specifikke kvalitative og/eller kvantitative analysemetoder til bestemmelse af antistoffer og antigener. Metoderne kendetegnes ved,
(1) at første trin i analyseproceduren består af adsorption af antigener eller antistoffer til en fast overflade (plastic, latex, glas),
(2) at antistof indgår i analysen
(3) at der i analysen anvendes et enzym, der co-valent er koblet til antigen, antistof eller andet specifikt molekyle.
ELISA metoderne, der blev udviklet i midten af 1970’erne og som siden er blevet raffineret og modificeret til talrige versioner, har vundet meget stor udbredelse, især i biologisk forskning og ved klinisk-kemisk og serologiske analyser.
Metoderne kan med ret simple midler tilpasses det øjeblikkelige behov, idet mange firmaer markedsfører et righoldigt udvalg af antigener, antistoffer, konjugater, substrater og andre hjælpemidler. Metoderne kan tilpasses enkelt og billigt laboratorieudstyr (som her), men kan også anvendes i forbindelse med computerstyret, automatisk udstyr, der tillader behandling af mange tusinde prøver dagligt. ELISA anvender kun ringe prøvemængde og er økonomisk mht. forbrug af de forskellige stoffer og besidder desuden høj følsomhed og pålidelighed.
I denne øvelse vil vi beskæftige os med den serologiske side af ELISA, nemlig metodens evne til at genkende antistoffer rettet mod bestemte virus-antigener og udtrykke koncentrationen af disse antistoffer i serum.
Dette kit er beregnet til 10 laboratorie grupper
Indhold
2 ELISA plader. Mikrotiterplader af polystyren (Pladerne har en speciel overflade, der gør dem egnet til at binde antigener eller antistoffer)
50 transfer pipetter
60 mikrotest tubes med låg
25 1 ml pipetter
2 plastic tubes, 50 ml
desuden
Destilleret eller de-ioniseret vand
Bægerglas (til restaffald)
37oC inkubations ovn
engangshandsker
sikkerhedsbriller
Generelle instruktioner og procedurer
Brug de dertilhørende mærkede plastic transfer pipetter til at fjerne opløsninger som omtalt under instruktioner for tilsætning af opløsninger og vaskning af brønde.
Tilsætning af reagenser til brøndene
· Brug den samme 1 ml pipette for tilsætning af reagenser
· RENS pipetten omhyggelig med destilleret vand før den anvendes igen til den næste reagens.
SE DEN ENGELSKE VEJLEDNING
1) Beskriv mekanismer ved ELISA testen. Hvorfor er ELISA så sensitiv? Hvorfor er der nødvendigt at blokere de steder, hvor der ikke er bundet noget antigen til overfladen af brøndene? Hvorfor er det vigtigt at have en positiv og negativ kontrol?
2) Hvorfor kan det tage adskillelige år inden AIDS bryder ud?
3) Hvorfor tester man for anti-HIV-1 IgG i stedet for selve virus?
4) Hvorfor bliver hele immunsystemet trykket når T-hjælpecellerne ødelægges?
5) Hvordan angriber HIV T-hjælpecellen?
6) Hvorfor er der så mange immunologiske varianter af HIV?
I professionelle laboratorier anvender man meget følsomme chromogene (farve danner) substrater til påvisningen af peroxid og peroxidase. De mest følsomme substrater er desværre også de mest giftige, så i denne øvelse er valgt et mindre følsomt, men harmløst stof ASA (aminosalicylsyre).
Det opløste ASA er næsten farveløst. Det kan oxideres (dehydrogeneres) af peroxid til en tungtopløselig, farvet forbindelse, men kun når processen katalyseres af peroxidase. Farvestyrken efter reaktionen bliver derved et mål for mængden af peroxidase og indirekte et mål for mængden af bundet primært antistof. Farve mængden kan på speciallaboratorier bestemmes vha. et spektrofotometer der sender monochromalt lys gennem brønd og plade og beregner lysabsorptionen ved passagen. I denne øvelse vil vi nøjes med at vurdere ”pr. øjemål”